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技术专栏:磷酸化蛋白WB尝试当苦衷项
蛋白磷酸化是一种极度沉要的翻译后加工，，，，，， ，，做信号通路必然是要检测蛋白磷酸化的，，，，，， ，，Western blot是评估蛋白磷酸化状态的最常用步骤，，，，，， ，，其实和跑正常蛋白没什么出入，，，，，， ，，只不外孵育的是鉴别磷酸化的抗体。。。。。。。下面腾博官网生物带各人总结一下尝试中确把稳重点。。。。。。。
一、关于磷酸化蛋白样品
裂解液问题蛋白的磷酸化是一个极度迅速的反映，，，，，， ，，取样品的过程要迅速，，，，，， ，，样品要新鲜，，，，，， ，，样品处置最好在冰上操作，，，，，， ，，操作功夫尽量短。。。。。。。用PBS洗涤细胞时，，，，，， ，，PBS肯定要4℃预冷。。。。。。。若是是组织的话，，，，，， ，，提取蛋白时选取液氮研磨的步骤，，，，，， ，，研磨用具最好提前预冷，，，，，， ，，维持低温的状态。。。。。。。
提取磷酸化蛋白的裂解液最好是新鲜配造，，，，，， ，，裂解液中肯定要有蛋白酶抑造剂和磷酸酶抑造剂，，，，，， ，，不然即便条带压出来也会很浅，，，，，， ，，了局也不成信。。。。。。。okadaic acid，，，，，， ，，NaF是磷酸酶抑造剂。。。。。。。再者，，，，，， ，，还要看你检测的蛋白磷酸化位点是什么氨基酸，，，，，， ，，若是是酪氨酸还要加1 u M的sodium vanidate即原钒酸钠，，，，，， ，，上样前不要煮沸，，，，，， ，，煮沸可能会粉碎其磷酸化位点。。。。。。。
二、关于WB时布景和条带的问题
磷酸化蛋白WB时布景也往往较深，，，，，， ，，所以压片功夫要适当，，，，，， ，，不能太长或过短，，，，，， ，，太长则布景太深挡住想要的那条带，，，，，， ，，功夫过短则可能没有条带或者条带太浅。。。。。。。做磷酸化蛋白WB时，，，，，， ，，除了指标蛋白的条带以表，，，，，， ，，往往会出现非特异性的条带。。。。。。。磷酸化抗体不好的话，，，，，， ，，甚至会压出非特异性的条带，，，，，， ，，反而没有你想要的条带，，，，，， ，，所以压片后，，，，，， ，，肯定要凭据Markers比对一下你压出的条带分子量是否正确。。。。。。。
三、关于蛋白总的表白量问题
钻研完某一蛋白的磷酸化情况后最好也要钻研一下该蛋白总的表白量。。。。。。。这有两种步骤，，，，，， ，，一是：一样的样品在分歧的孔中上样两次（可在一样的胶上，，，，，， ，，也可在分歧的胶上），，，，，， ，，其一压磷酸化蛋白，，，，，， ，，另一压该蛋白总的表白量（蕴含磷酸化和未磷酸化的该蛋白），，，，，， ，，甚至还可跑另一个胶，，，，，， ，，压内标。。。。。。。但是通常不建议如此做，，，，，， ，，由于这样比力时误差还是较大的。。。。。。。因而，，，，，， ，，比力公认的，，，，，， ，，也是常用的步骤，，，，，， ，，即用strip液将原先结合上的磷酸化抗体及二抗洗去，，，，，， ，，而后用统一张膜压总蛋白。。。。。。。而后再洗脱一次，，，，，， ，，再压内标。。。。。。。
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